西湖大学常兴课题组运用自主开发的 CRISPR-AID（TAM）碱基编辑器
（Nature Method-2016），创建了针对 RNA 剪接的遗传操作体系 （Molecular
Cell-2018），成功的实现了针对 RNA 剪接的“loss of function”和”gain of
function”调控，对于多种因 RNA 剪接异常造成的罕见疾病提供了理论上的治疗基础，并持续探索在其他罕见病中的应用。

目前，西湖教育基金会已将项目筹款565006.24元拨付西湖大学，用于定向支持高晓飞教授课题组的罕见病研究项目。该项目已在西湖大学科技合作部完成立项。

目前，西湖教育基金会已将项目筹款565006.24元拨付至西湖大学，用于定向支持高晓飞教授课题组的罕见病研究项目。该研究项目已在西湖大学科技合作部完成校内立项手续。现将该项目情况公示如下：

项目名称：

单细胞转录组测序分析揭示罕见病先天性纯红细胞再生障碍性贫血（DBA）的致病机理和基因治疗方案

一、项目概述

1、项目研究背景

人体干细胞的正确自我复制与分化对人体器官的发育十分重要，如果发生错误，会造成组织器官发育缺陷等重大疾病。红细胞是人体最多的细胞，大约占总细胞数的1/4，是由红系祖细胞(BFU-E)细胞分化而来。为了保证大量红细胞的产生，BFU-E细胞内不同的细胞信号通路与转录因子需要相互作用，保证其正常自我复制与分化。如果BFU-E自我复制出现问题会造成严重的血液疾病，如罕见的先天性纯红细胞再生障碍性贫血（Diamond-Blackfan Anemia，DBA）。

DBA是一种罕见的先天性骨髓衰竭性疾病，多发现于0至2岁儿童中，目前已经纳入我国第一批罕见病目录。欧美国家DBA的发病率约5/100万-7/100万，我国暂时没有DBA发病率的统计结果。DBA患者由于骨髓中的BFU-E细胞自我复制能力较低，不能产生足够量的下游成熟红细胞，造成病人严重的贫血。DBA是一种异质性遗传疾病，在40%至50%的病例中以常染色体显性遗传的方式遗传，其余55%至60%的病例同时是偶发的。约1/3的DBA患者临床上会表现发育迟缓、身材矮小，肢体畸形（如拇指三界指骨）、先天性心脏病等症状，且DBA患儿易患急性非淋巴细胞白血病及非造血系统肿瘤，危机生命。序列分析发现仅约25% DBA患者具有核糖体蛋白S19（ribosomal protein S19，RPS19）基因突变，此外还包括其他核糖体蛋白基因，例如RPS17，RPL5，RPS24，RPS7等。

尽管在DBA的分子基础研究方面取得了一定进展，并且对DBA病理基础有了进一步的了解，但是在具体的治疗方法研究上依旧存在各种各样的问题。目前为止，治疗DBA的两种主要方法分别是长期的皮质类固醇疗法与定期输血。虽然目前最主要的临床用药——糖皮质激素的长期治疗可以在一定程度上缓解病人症状，但是这种方法的药理机制未明，不能根治DBA。除此之外，在婴幼儿时期长期使用大剂量激素的治疗会引发严重不良反应，阻碍正常发育，容易产生小儿生长延缓、运动神经延迟等并发症，且有些患者对此方法不敏感或者容易复发；另一种缓解病症的方法是输血治疗。为弥补糖皮质激素治疗方法的缺陷，选择输血治疗的病人需要长期反复输血以纠正贫血症状，但是这种方法容易使得大量外源性铁在体内蓄积引起继发性铁超负荷的不良并发症，累及心肌、肝脏等多个器官。因此在治疗DBA疾病本身之外患者还需要长期检测体内铁储蓄量和进行除铁治疗。除上述两种疗法之外，若存在健康的、HLA相同的亲属，可以考虑异体骨髓移植。

针对DBA治疗手段面临的各种挑战以及DBA的遗传异质性，课题组将目光转向从分子机制出发的靶向基因疗法。本研究目的是通过单细胞转录组测序技术分析DBA的病理机制以及基因治疗方法。该实验通过获取患者的外周血单个核细胞，利用细胞标记物识别的方法筛选得到lineage negative cells，对其进行单细胞转录组测序，再利用生物信息学技术分析DBA的遗传异质性、病理机制，得到DBA患者红细胞生成通路中的异常表达基因，验证其与造血干细胞红系分化的关系以及重要性，以确定基因治疗靶点。通过靶向基因治疗的方法可以有效克服目前糖皮质激素不能根治疾病以及骨髓移植资源稀缺等问题。本项目的研究成果将为未来DBA临床治疗提供有效的基础研究支持。

2、项目可行性分析

2.1研究基础可行性分析

19世纪80年代以来针对DBA致病性分子机制的研究，逐渐打开了我们对这组罕见遗传病的认识。在大多数患者（75%）中都可以发现腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)升高。这种变化在DBA的小鼠及斑马鱼动物模型中也得到了证实, 成为诊断DBA的重要临床指标。

罕见病数据库的建立和现代测序技术的应用揭示了约有70%的DBA患儿携带核糖体蛋白（ribosomal protein）基因突变，至今为止，有不少于19种核糖体蛋白突变在DBA患者中被发现。其中核糖体蛋白S19(RPS19)的突变是最常见的，占整体患儿的20-25%。这些研究结果不仅仅使得DBA成为第一个证实与核糖体功能受损相关的疾病，而且为临床分子诊断提供了精准的依据。

现在科学工作者们可以通过诱导的基因变异的动物模型开展更有针对性的研究，在挖掘发病机制的同时，为靶向药物的筛选提供了重要的模型。科学家们发现，在病人来源的淋巴细胞中引入载体携带的外源性RPS19基因可以完全缓解细胞内的核糖体蛋白合成不足和功能障碍。这项令人振奋的研究，为基因修正性治疗罕见遗传性疾病的应用开启了一扇大门。

除了核糖体蛋白以外，重要的红细胞系转录调控因子GATA1的突变也在少数患者中有所报道。血红素随后下调GATA1，GATA1目标基因和有丝分裂纺锤体基因，以使红系分化正常终止（图1）。与此同时，铁代谢机制的异常也表明与DBA患者的红细胞分化生成受损相关。研究数据显示，血红素和球蛋白比例失衡或是抑制正常红细胞分化，成熟的关键。

图 1：单细胞分析表明血红素- GATA1反馈环调节红细胞分化

使用患者诱导多能干细胞为模型进行药物筛选，研究者发现了可能用于靶向临床治疗的自噬体诱导因子SMER28，可以在体外培养系统中有效的提升球蛋白表达水平和红细胞生成率。

2.2科研队伍可行性分析

项目负责人高晓飞教授在细胞生物学、分子生物学和生物化学方面已经积累了多年丰富的理论和实践经验，博士后期间于美国科学院院⼠、麻省理⼯学院怀特海德研究所 Harvey Lodish 实验室独立开展一系列工作，研究红细胞发育中的转录、红系祖细胞自我更新的机理，对人及小鼠红系发育系统掌握良好，并且建立更高效的细胞分离培养方法（Gao*, Lee* et al. PNAS, 2018; Gao*, Lee* et al. Blood, 2017; Lee*, Gao* et al. Nature, 2015）。课题组包含一名细胞生物学实验经验丰富的博士后以及一名熟悉单细胞转录组数据分析的博士生，成员配置合理，能够在申请人的指导下积极正确的开展实验以及分析，且依托单位西湖大学具备丰富技术平台资源，包括本项目所有需求的仪器设备，为本项目的顺利进行提供良好保障。

课题组所在实验室也有丰富的临床资源支持，并已经与首都儿童医院合作，通过非诺贝特联合糖皮质激素使用治疗DBA的临床伦理。同时，实验室与多个DBA家庭建立了良好联系，患者家庭自愿提供临床血液样本进行实验研究，为本项目的研究技术与药物开发奠定基础。

二、项目研究进展

前期一系列关于DBA分子机制的研究成果为我们进行单细胞转录组分析提供了一定的参考材料，课题组已经在一种血液疾病（非DBA）的单细胞转录组分析中得到RPS家族RNA表达异常的结果，并且通过富集通路分析得到Ribosome通路在患病人群与正常人群之间调控异常。课题组下一步会将实验分析结果与已经存在的研究结果结合起来进行再分析，以确保能够获取可信度更高的分析结果。业内专家表示，针对性的修正红系分化调节机制将大幅度减少DBA及多种再生障碍性贫血的病人的输血依赖性，将在未来提供更安全的纠正贫血的手段，这为本项目致力于靶向基因治疗的研究方向提供了充分的理论基础。

同时，本项目选择使用擅长于进行组织/细胞异质性的单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）对DBA患者及正常人的外周血Lineage negative cells进行下游分析。日渐成熟与丰富的单细胞转录组分析平台的诞生为单细胞转录组分析实验提供了良好的技术支持，极大的完善了 scRNA-seq 中细胞分离与建库测序的实验方法与步骤。除此之外，相关研究人员就 scRNA-seq 的数据结构进行研究，开发了大量区域成熟的分析模块，比如 Seurat、Scanpy、SingleR、Monocle 等应用于 R 语言或者 Python 语言的集成包，为我们进行 scRNA-seq 下游分析提供了有力的支持。课题组已经进行过单细胞转录组分析的相关实验项目，并且建立了成熟的实验与分析流程，积累了一定的经验，为本项目提供了坚实的技术支撑。

三、项目优势及创新点 

1. 临床样本的选择。

先前的研究主要是以患者的骨髓为主，而该项目则采用少量外周血液作为样本进行研究，其优势在于不仅样本获取方法便捷，而且可极大程度减轻患者儿童骨髓取材的痛苦；

2. 筛选外周血lineage negative cells作为实验材料。

实验中利用成熟细胞表面标记物作为kit对外周血进行筛选，获取lineage negative cells，利用造血干细胞进行测序分析更加有利于研究DBA的分子机制以及细胞分化过程。

3. 选择使用单细胞转录组测序数据。

为了有效快速筛选出潜在治疗靶点，同时考虑细胞异质性，利用高通量的方法分析单个细胞在DBA患者以及正常人体中的表达差异。单细胞转录组测序分析是近几年流行的，目前已经运用到多种疾病研究中。日渐成熟与丰富的单细胞转录组分析平台的诞生为单细胞转录组分析实验提供了良好的技术支持，极大的完善了 scRNA-seq 中细胞分离与建库测序的实验方法与步骤；

4. 成熟的单细胞转录组分析技术。

相关研究人员就 scRNA-seq 的数据结构进行研究开发了大量区域成熟的分析模块，比如 Seurat、Scanpy、SingleR、Monocle 等应用于 R 语言或者 Python 语言的集成包，为我们进行 scRNA-seq 下游分析提供了有力的支持。本实验室已经利用单细胞转录组分析技术进行过一系列项目的研究，并且建立了成熟的分析流程。该项目选择从细胞聚类、拟时序分析以及差异表达基因分析等角度展开，能够进一步得到DBA患者红细胞生成通路中的异常表达基因以及调控方向，解析DBA遗传异质性、病理机制，对今后的临床实践提供基础研究支持。

四、项目（研究）计划及拟实现的目标或拟解决的问题（如有详细资料请附页说明）

项目实验设计

本实验通过获取DBA患者及正常人的外周血单个核细胞，利用细胞标记物识别的方法筛选得到lineage negative cells，对其进行单细胞转录组测序，利用生物信息学技术分析DBA的遗传异质性、病理机制，得到DBA患者红细胞生成通路中的异常表达基因，并且通过小鼠实验进行体内验证与回补治疗研究。通过靶向基因治疗的方法可以有效克服目前糖皮质激素不能根治以及骨髓移植资源稀缺等问题。本项目的研究成果将为未来DBA临床治疗提供有效的基础研究支持，具体实验设计如下：

1. 实验材料准备（图2）

首先收集DBA患者与正常人的血液样本，通过离心的方法获取外周血单个核细胞。接下来利用human cell lineage detection kit（注意不同的kit包含有不同的lineage positive cells markers，因此剔除的细胞也不完全相同）对外周血进行过滤，筛选去掉一些终末分化细胞以得到lineage negative cells。最后利用这些细胞悬液进行单细胞转录组测序。

图 2：实验材料准备流程图

2. 单细胞转录组测序（图3）

通过上一阶段获得DBA患者与健康人外周血lineage negative cells悬液，利用基于Drop-seq的10X平台或者基于微流控孔道的BD平台进行单细胞捕获，这个过程中要确保每个细胞与带有barcode（细胞条形码序列）的磁珠结合。接下来要将与磁珠结合单细胞破裂，对所有的mRNA进行逆转录，PCR扩增后构建测序文库。最后进入测序平台进行测序，以提供下一阶段进行下游分析的单细胞转录组测序数据。

图 3：单细胞转录组测序流程图

3. 实验数据分析（图4）

首先讲上一阶段得到的单细胞转录组测序原始数据进行预处理，主要是去批次和标准化处理，得到表达矩阵后用于下游分析。下游分析流程主要分为三个方向：①细胞亚群聚类分析，目的是进行细胞类型注释；②拟时序分析，目的是关注细胞分化过程以及细胞命运；③差异表达分析，目的是寻找关键基因并且进行富集通路分析。最后将分析结果与已经存在的研究结果结合分析，以获取可信度更高的基因治疗靶点，为临床治疗实验提供基础理论思路。

图 4：单细胞转录组测序数据分析流程图

综上所述，本项目的研究目的是通过单细胞转录组测序技术分析DBA的病理机制以及基因治疗方法。本实验采用外周血作为临床实验样本，获取方式不仅方便便捷，而且极大程度减少了患者被取材的痛苦。实验中利用成熟细胞表面标记物作为kit对外周血进行筛选，获取lineage negative cells，利用造血干细胞进行测序分析更加有利于研究DBA的分子机制以及细胞分化的过程。采用了单细胞转录组分析技术，更有利于分析疾病发生过程中的细胞分化过程以及细胞异质性，由于DBA是一种红细胞生成缺失疾病，因此对于特定细胞类型的研究非常有必要。最后将本项目分析结果中关键基因或者通路与已进行的研究结合分析，重点验证其与造血干细胞红系分化的关系以及重要性，以确定基因治疗靶点。单细胞转录组分析在研究DBA等罕见病的致病机理上占据很大优势，同时靶向基因治疗的方法将很有潜力成为治愈这些疾病的关键手段。

附：研究进度安排